Bacteriologie

typhoid_bacterie

De medisch microbiologische diagnostiek houdt in het direct en/of indirect aantonen van
microbiële ziekteverwekkers, te weten
• bacteriën,
  inclusief gevoeligheidsbepaling
• virussen
• schimmels en gisten
• parasieten,
  voornamelijk Protozoa en wormen

Microbiologisch onderzoek kan verricht worden om diverse redenen:
• voor het stellen c.q. bevestigen van de diagnose
• om therapeutische redenen, vooral bij bacteriële infecties
• om epidemiologische redenen met name contactonderzoek, epidemieën
In de huisartsenpraktijk wordt voor bacteriële infecties vaak met succes een antibioticum
voorgeschreven zonder een kweek vooraf. Wanneer een infectie echter niet of onvoldoende

reageert, is het onjuist om "blind" een tweede of zelfs daarna een derde antibioticum te kiezen.
Een (herhaalde) inadequate therapie geeft kans op
• irreversibele beschadiging van weefsel (long, nier)
• missen van een belangrijke diagnose
• resistentievorming van bacteriën
Als een bacteriële infectie niet reageert op blind voorgeschreven antibiotica
is een kweek noodzakelijk.

DIRECTE METHODEN

Deze methoden berusten op het direct aantonen van
• de complete ziekteverwekker
. door microscopie
. door kweek
• onderdelen van de ziekteverwekker
. antigenen
. genetisch materiaal DNA/RNA

MICROSCOPIE

Het microscopische preparaat speelt een belangrijke rol bij de parasitologische diagnostiek en
- in mindere mate - bij de diagnose van lokale schimmelinfecties. Ook bij enkele specifieke
bacteriële ziekteverwekkers kan het microscopische preparaat nuttig zijn, zoals bij tuberculose
(auramine of Ziehl-Neelsen preparaat).
In deze gevallen kan een positief resultaat op eenvoudige en snelle wijze een waarschijnlijkheidsdiagnose
opleveren.
Om bacteriën in een preparaat te kunnen zien, zijn minimaal 104/ml nodig, zodat een negatief  
resultaat de diagnose niet uitsluit.
Een Gram-prepraat uitsluitend aanvragen in combinatie met een kweek.

KWEEK

Bij vele bacteriële infecties is het kweken van de ziekteverwekker de beste methode voor het
stellen van de diagnose:
• de kweek is gevoelig en specifiek
• de kweek is geschikt voor zowel een algemene vraagstelling (b.v. urineweginfectie) als
een specifieke (b.v. kinkhoest, Campylobacter)
Kweken van de ziekteverwekker heeft het voordeel dat een gevoeligheidsbepaling kan
worden verricht. Dit biedt de mogelijkheid een gerichte antimicrobiële therapie in te stellen.
Kweek is niet altijd gemakkelijk en mogelijk. Ziekteverwekkers worden dan vaak op indirecte
wijze met serologische reacties aangetoond.

AANTONEN VAN ANTIGEEN

Het aantonen van antigenen wordt vooral toegepast bij virale infecties. Meestal geschiedt dit
in het bloed (b.v. HBsAg), maar dit kan ook in andere materialen, b.v. rotavirus of Helicobacter in faeces,
respiratoir syncitiaal virus in een nasofarynx-uitstrijk.
De meest gebruikte techniek is de enzyme immuno assay (EIA). Deze techniek is snel en
heeft een hoge gevoeligheid.
Het aantonen van antigeen is alleen bruikbaar indien wordt gedacht aan een bepaalde
ziekteverwekker. Het antwoord is dan ook ja of nee. Andere ziekteverwekkers worden niet
aangetoond. Deze moeten apart worden aangevraagd.

AANTONEN VAN GENETISCH MATERIAAL

Het aantonen van genetisch materiaal geschiedt met behulp van moleculair-biologische
methoden. Deze moderne methoden zijn sterk in opkomst. In het algemeen kan gesteld worden dat de methoden snel en zeer gevoelig zijn. Bij de praktische toepassing in de diagnostiek ligt het accent vooralsnog op ziekteverwekkers, die moeilijk zijn te kweken of waarvan de kweek lang duurt, zoals Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae en Mycobacterium tuberculosis.
Ook deze methoden geven uitsluitend antwoord op een specifieke vraagstelling. Een
gevoeligheidspatroon kan niet worden bepaald. Andere ziekteverwekkers worden niet
aangetoond.

INDIRECTE METHODEN

Directe methoden zijn niet altijd makkelijk en mogelijk. In dergelijke situaties wordt getracht de
ziekteverwekker op indirecte wijze aan te tonen. Indirecte methoden berusten op het aantonen
van de reactie van het menselijke lichaam op deze ziekteverwekker:

  • een cellulaire immuunreactie
  • produktie van antistoffen (serologische reacties)

In de praktijk worden vrijwel uitsluitend serologische reacties toegepast, omdat het aantonen
van een cellulaire immuunreactie doorgaans te complex is.
Serologische reacties brengen echter beperkingen met zich mee

  • De antilichaam productie van het lichaam op een antigeen kan laag of totaal uitblijven
  • De tijdsfactor: het lichaam heeft tijd nodig om de antistofproduktie op gang te brengen.

Met name in de acute fase zijn vaak nog geen antistoffen aantoonbaar
Een negatieve serologische reactie, met name in de acute fase, sluit een infectie
niet uit.
• Serologische onderzoeken kunnen kruisreacties tonen omdat antigenen onderling
verwantschap kunnen hebben. Daardoor kunnen fout-positieve resultaten optreden.
Daarom is het soms noodzakelijk de specificiteit van een positieve reactie door
aanvullende (confirmatie-)reacties te bevestigen, b.v. een positieve luesreactie (FTA-abs)
. een positieve anti-HIV reactie (western blot)
• Antistoffen blijven soms lang aantoonbaar, waardoor serologische reacties - ook bij
genezing - jaren tot levenslang positief kunnen blijven. Een positieve reactie bewijst
contact met het antigeen in het verleden, maar geeft niet altijd informatie over het
tijdstip waarop.
Daarom is men gaan kijken naar de aard van de antistoffen:
. IgM-antistoffen worden in de acute fase aangemaakt en verdwijnen relatief
snel
. IgG-antistoffen verschijnen iets later en blijven lang, soms levenslang, aantoonbaar.
IgM-antistoffen duiden dus in het algemeen op een recente infectie.
De huidige technieken zijn echter zo gevoelig geworden dat het aantonen van IgMantistoffen
niet altijd betekent dat de infectie nog actueel is. Daarom wordt steeds
vaker gekeken naar stijging van IgG titers in een serumpaar.
In vele situaties moet voor serologisch onderzoek een serumpaar worden ingezonden
met tenminste 10 dagen tussenpoos.
Een infectie is serologisch "bewezen"

  • bij seroconversie: de reactie is in het eerste serummonster negatief en is in het tweede serummonster duidelijk positief geworden
  • bij een significante (viervoudige) stijging van de titer of het aantal eenheden









MOLECULAIR BIOLOGISCHE METHODEN

DEFINITIE
Onder moleculair biologische methoden worden in dit kader verstaan technieken waarbij
microbieel DNA zonder kweek direct in patiënt-materiaal kan worden aangetoond.
Er zijn een aantal micro-organismen zoals Chlamydia, gonococcen (GO), mycobacteriën en
sommige virussen die moeilijk c.q. langzaam groeien of helemaal niet te kweken zijn, terwijl
moleculair biologische technieken snel een antwoord kunnen geven.
De twee belangrijkste zijn:
• directe probe (hybridisatie) technieken
• amplificatie technieken

RELEVANTE EIGENSCHAPPEN VAN DNA
DNA, de belangrijkste “bewaarplaats” van genetische informatie in de cel, is een dubbelstrengs
molecuul in de vorm van een helix. Beide strengen zijn opgebouwd uit 4 verschillende
nucleotide basen: adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en thymine (T). Doordat adenine
altijd waterstof- bruggen vormt met thymine en cytosine altijd met guanine zijn beide strengen
aan elkaar gekoppeld.


De waterstofbruggen tussen de twee DNA strengen kunnen van elkaar worden gescheiden
door verhitting of door een hoge pH. Dit proces wordt denaturatie genoemd.
DNA is het meest stabiel in de dubbelstrengsvorm. Als twee complementaire stukjes
enkelstrengs DNA bij elkaar worden gebracht, zullen deze dan ook samen weer een dubbele
structuur vormen. Dit wordt hybridisatie genoemd. De stabiliteit van het hybridisatie produkt
is hoofdzakelijk afhankelijk van de nucleotide-volgorde van beide strengen. Twee 100%
complementaire strengen vormen een zeer stabiel dubbelstrengs DNA. Wanneer echter 1 of
meer basen verschillen, zal er een zwakke of zelfs geen hybridisatie plaats vinden.
Vrijwel alle micro-organismen bevatten enkele unieke nucleotide-volgorden in hun genoom.
Deze unieke nucleotide-volgorden vormen de basis voor de DNA diagnostiek en worden
daarom doelwit DNA genoemd.

DIRECTE PROBE (HYBRIDISATIE) TECHNIEKEN

PRINCIPE
De eerste stap bij deze technieken is meestal vrijmaken van het in het patiënten materiaal
aanwezige DNA. Na denaturatie van het DNA wordt een probe toegevoegd. Een probe is een
korte streng van synthetische nucleotiden die hybridiseert met het doelwit DNA van het aan te
tonen micro-organisme.
Om nuttig te zijn voor de diagnostiek moet een probe voldoen aan de volgende eisen:
• de probe moet specifiek zijn voor het doelwit DNA in het genoom van het aan te tonen
micro-organisme
• de probe mag niet hybridiseren met menselijk DNA
• de probe moet na hybridisatie eenvoudig aangetoond kunnen worden

TOEPASBAARHEID IN DE ROUTINE
Ondanks de zeer hoge specificiteit is de waarde van directe probe technieken door de relatief
lage gevoeligheid voor de routine diagnostiek beperkt. De reden hiervoor is dat er minimaal
10.000 kopieën van het doelwit DNA in het patiënten materiaal aanwezig moeten zijn.
Wanneer in het aan te tonen micro-organisme slechts één kopie van het doelwit DNA
aanwezig is, betekent dit dat er minimaal 10.000 micro-organismen in het klinische materiaal
aanwezig moeten zijn om een positieve testuitslag te verkrijgen.

AMPLIFICATIE TECHNIEKEN

PRINCIPE
Vaak is het aantal micro-organismen c.q. de hoeveelheid doelwit DNA in patiënten materiaal
te gering om met een probe aangetoond te kunnen worden. Het doelwit DNA moet daarom
eerst sterk in hoeveelheid vermeerderd worden: amplificatie.
Bij de meest toegepaste amplificatie technieken zoals PCR (polymerase chain reaction) wordt
het doelwit DNA circa 100 miljoen maal vermenigvuldigd.

TOEPASBAARHEID IN DE ROUTINE
De specificiteit van amplificatie technieken is zeer hoog. Daarnaast hebben deze technieken
een zeer hoge sensitiviteit: de detectiegrens ligt bij 1 tot 10 kopieën van het doelwit DNA.
Toch zijn er ook nadelen:
• Er wordt geen onderscheid gemaakt tussen DNA afkomstig van levende of dode
bacteriën. Een positieve testuitslag betekent niet persé dat er (nog) sprake is van een
infectie.
• Er wordt uitsluitend antwoord gegeven op een gerichte vraag en niet op een open
vraag zoals dat bij de kweek het geval is. Andere micro-organismen dan het
aangevraagde worden dus per definitie niet gevonden.
• Er wordt geen informatie gegeven over het resistentiepatroon.